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Die Verteilung dieser Zellmuster sowie der Anteil an Zellen insgesamt ist engverbunden mit Form und Funktion des Gelenks, sodass man zu dem Schlusskommen kann, dass jedes Gelenk eine individuelle und iligeBeanspruchungderGelenkoberfläche, besitzt.Als ein fünftes „pathologisches Zellmuster“ ist noch der Double-String zunennen, der allerdings nur in Gelenkknorpel gefunden wurde, der sich inunmittelbarer Nähe fokaler Arthrose-Läsionen befand und somit als arthroseassoziiertes Zellmuster angesehen werden muss. Entsprechend diesempathologischen Muster zeigt sich ebenfalls eine Veränderung der prozentualenZusammensetzung der vier üblichen Muster in einem von Arthrose befallenenGelenk [30].1.2.Therapiemöglichkeiten bei KnorpeldefektenAls bradytrophes Gewebe besitzt der hyaline Gelenkknorpel ein nur limitiertesRegenerationspotential. Dies hat zur Folge, dass Schäden, wie z.B. ein Traumaoder Erkrankungen wie Osteochondrosis dissecans [31] oder andereKnorpeldefekte häufig sekundär in eine Arthrose münden [32-36]. Durch dieneuroanatomische Besonderheit einer fehlenden Nervenversorgung desKnorpels bleiben Schädigungen im Frühstadium häufig asymptomatisch undklinisch inapparent. Für die Klassifikation von Knorpelschäden wird imAllgemeinen die Einteilung nach ICRS favorisiert [37], die eine Erweiterung dervierstufigen Outerbridge-Klassifikation (1961) darstellt.Die Behandlungsmöglichkeiten können unter anderem eingeteilt werden inTransplantationsverfahren, zu denen die autologe Chondrozytentransplantation(ACT) und die osteochondrale Transplantation (OCT, Mosaikplastik) zählen,und in knochenmarkstimulierende Verfahren wie Mikrofrakturierung [35]. BeiLetzterem wird ein Knorpelschaden induziert, der bis in den tipotentenKnochenmarksstammzellen führt, die ein Reparaturgewebe ausbilden, das vorallem aus Faserknorpel besteht. Dieser scheint aber im Vergleich 4demmehrhyalinartigen

Regeneratknorpel nach ACT unterlegen zu sein [38-40]. Indikationen fürMikrofrakturierung sind vor allem fokale Knorpelschäden ohne Verlust vonKnochen, die von normalem Knorpelgewebe umgeben sind [41, 42]. Denwichtigsten limitierenden Faktor stellt hierbei die Defektgröße dar.Demgegenüber steht die ACT, die erstmalig 1994 beschrieben wurde [20] undbei der heute drei „Generationen“ von Verfahrenstechniken unterschiedenwerden. Als 1. Generation wird die periostlappenassoziierte ACT bezeichnet.Hierbei kommt es zur Defektdeckelung mit autologem Periost unterVerwendung einer Zellsuspension. Demgegenüber steht die 2. Generation mitAbdeckung durch eine Kollagenmembran, ebenfalls unter Verwendung einerZellsuspension, und schließlich ist als 3. Generation die Implantation eineszellbesiedelten, dreidimensionalen Trägermaterials im Sinne des TissueEngineering zu verstehen [43]. Diese proteinbasierten Biomaterialien, wie z.B.Novocart (TETEC, Reutlingen, Deutschland) basieren auf Kollagen Typ I und III[29]. Der Vorteil der 3. Generation im Vergleich zu den beiden früheren ACTGenerationen liegt zum einen im leichteren Umgang durch die fehlendeNotwendigkeit einer wasserdichten Fixierung der Membran, die für dasUnterspritzen der Zellsuspension unerlässlich ist, und zum anderen in derniedrigeren Komplikationsrate, speziell im Vergleich zur Periostlappentechnik[44, 45], sodass diese Einzug in den klinischen Alltag gehalten hat und derregenerativenKnorpeltherapie gilt.Klinisch wird dem Patienten in einer ersten Operation Knorpel aus vitalgesunden Zonen entnommen, die Chondrozyten werden isoliert und in Kulturgebracht. Nach Erreichen der entsprechenden Zellzahl (derzeit werdenaufgrund empirischer Erfahrungswerte ca. 1-2 Millionen Zellen pro cm2Defektfläche empfohlen [35]) werden diese auf eine schwammähnlichedreidimensionale Matrix übertragen (Verfahren der 3. Generation). Nachentsprechender Anheftung der Zellen kann die Matrix in einer zweitenOperation in den Knorpeldefekt eingebracht werden.Hierzu zeigen diverse Studien, dass der ausgebildete hyalinartige Knorpel imVergleich zum hyalinen Gelenkknorpel weder klinisch noch histologisch eine5

annähernde Qualitäterreicht [39, 46, 47]. Verschiedene Studien zeigendarüber hinaus auch Vergleiche zu Alternativverfahren wie beispielsweise teVerbesserungderGelenkfunktion im Vergleich zum präoperativen Zustand sowie eine dauerhafteHaltbarkeit des Regeneratknorpels nach ACT [52-54].Über die genaue Indikationsstellung der ACT wird sehr kontrovers diskutiert.Konsens besteht aber vor allem in dem Punkt, dass sie sich in erster Linie beigrößeren Defekten ( 3-4 cm2) mit deutlich besserer Wirksamkeit gegenüberVerfahren wie Mikrofrakturierung und OCT zeigt [48, 55] und aktuell ternativendafürzurVerfügung stehen.Eine mögliche Orientierungshilfe zeigt die Arbeit von Niemeyer, P. et al.(Abb. 3) bezüglich der geeigneten Auswahl der Verfahren im Hinblick aufDefektgröße, Aktivitätsgrad und Patientenalter. Ursprünglich wurde die ACT fürPatienten zwischen dem 18. und 50. Lebensjahr empfohlen. Nach derderzeitigen Studienlage ist die Wirksamkeit der ACT-Therapie grundsätzlichauch bei Kindern und Jugendlichen [56, 57] sowie älteren Patienten gegeben[58].Abbildung 3: Synopse verschiedener Therapiemöglichkeiten bei KnorpeldefektenOrientierungshilfe für die Auswahl des geeigneten Verfahrens zur biologischen Rekonstruktionisolierter Knorpelschäden des Kniegelenks in Abhängigkeit verschiedener ation; OCT: osteochondrale Transplantation) [35].6

Weitere wichtige Determinanten des Behandlungsergebnisses nach autologerChondrozyten-Transplantation stellen patientenspezifische Faktoren wie BodyMass-Index [59, 60], Nikotinkonsum [61] und auch die Anzahl vonVoroperationen am Kniegelenk dar [62-64]. Ebenso spielen Defektgröße,-anzahl und -lokalisation eine tragende Rolle, da beispielsweise retropatellareDefekte im Vergleich zu Defekten der Femurkondyle mit einem schlechterenBehandlungserfolg einhergehen [65].Zusammenfassend lässt sich konstatieren, dass die ACT als etablierte Methodeund wichtiger Bestandteil knorpelregenerativer chirurgischer Therapie ellt,dieständigweiterentwickelt und verbessert wird, sodass sie in Zukunft u.a. auchAnwendung in anderen Gelenken wie Schulter und Hüfte finden wird, wozubisher nur wenige Einzelfallberichte vorliegen [66-68].1.3.Ziele der ArbeitDas primäre Ziel dieser Arbeit bestand darin, die Residualanteile von ntatenunterfolgendenFragestellungen zu untersuchen: Unterscheiden sich die humanen ACTs lldichteundZellverteilung?Lassen sich daraus resultierende Unterschiede in der nundPro-CollagenIIC-Propeptiden im nachfolgenden Laborexperiment darstellen und quantifizieren?Darüberhinaus sollten drei differente Mikroskopieaufnahmetechniken ufSensitivität,Abbildungsleistung und mögliche praktikable Umsetzung im klinischen Alltagvergleichend analysiert und bewertet werden.7

2. Material und Methoden2.1. Geräte Abzug (Prutscher, Österreich) Analytische Waage (Max: 220 g, Min: 10 mg, Kern, Deutschland) Brutschrank (CO2-Auto-Zero, Binder, Deutschland) Canon EF-S 60 mm 1:2,8 Makro USM Objektiv (Canon, Deutschland) Canon EOS 70D SLR-Digitalkamera (Canon, Deutschland) ELISA-Reader (Biotek, USA) Gefrierschrank – 24 C (Liebherr Premium, Deutschland) Kühlaggregat (Bachofer, Deutschland) Kühlschrank 4 C (Liebherr, Deutschland) Kühlschrank 4 C (Severin, Deutschland) Magnetrührer (IKA, Deutschland) Mikropipetten (Eppendorf, Deutschland) Mikroskop (Axio Observer.Z1 Carl Zeiss, Deutschland) Mikroskop (Leica DMIL, Leica, Deutschland) Monochromator infinite M200Pro (Tecan, Schweiz) Pipettierhilfe (Pipetus Akku, Hirschmann Laborgeräte, Deutschland) pH-Meter (Mettler Toledo, Schweiz) Rüttelplatte (IKA, Deutschland) Sterilbank (BDK, Deutschland) Thermomixer (Eppendorf, Deutschland) Vakuum-Pumpe (Edwards, England) Vakuum-Zentrifuge (Bachofer, Deutschland) Wasserbad (Medingen, Deutschland) Zentrifuge (Eppendorf, Deutschland)8

2.2. Gebrauchsmaterialien Blue Cap (15 ml, 50 ml, Greiner bio-one, Deutschland) Deckgläser für Objektträger (24x40 mm, 24x50 mm, 24x60 mm,R. Langenbrinck, Deutschland) Eppendorf-Tubes (1,5 ml, 2 ml, Eppendorf, Deutschland) Filterpapiere (ø 150 mm, Macherey-Nagel, Deutschland) Kollagen-I Matrix (Jotec, Deutschland) Neubauerzählkammer (Assistent, Deutschland) Pipetten (2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml, BD Falkon, Deutschland) Petrischale (145/20 mm, Greiner bio-one, Deutschland) Skalpell (Nr. 21 Surgical disposable scalpels, Feather, Japan) Well-Platten (Greiner bio-one, Deutschland) Zellkulturflaschen (75 cm2, BD Falcon, USA) Zellsieb (100 µm, BD Falcon, USA)2.3. Chemikalien 1,9-Dimethylmethylen Blau Chlorid (DMMB, Polysciences, USA) 3%ige Essigsäure (Merck, Deutschland) 4’, 6’-diamidin-2’-phenylindoldihydrochlorid (DAPI, Roche, Schweiz) Aceton (Merck, Deutschland) Alcianblau 8 GX (Merck, Deutschland) Chondroitin-Sulfat (Sigma-Aldrich, Deutschland) CyQUANT NF dye regent (life technologies, USA) Ethanol (Merck, Deutschland) Formaldehydlösung mind. 35% (Merck, Deutschland) Glycin (Carl Roth, Deutschland) HBSS buffer (life technologies, USA) Natriumchlorid (Merck, Deutschland) Natriumazid (Merck, Deutschland) Phosphatpuffer (Dulbecco’s PBS, PAA, Österreich)9

Proteinase K (Thermo Scientific, Deutschland) Sprühdesinfektion (Descosept AF, Dr. Schumacher GmbH, Deutschland) Steriles Wasser (Ampuwa, Fresenius Kabi, Deutschland) Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich, Deutschland) Trypan Blue Solution (0,4%, Sigma-Aldrich, Deutschland)2.4. CPII ELISA KIT TMB (14 ml, IBEX Pharmaceuticals Inc.) Stop Solution (14 ml, IBEX Pharmaceuticals Inc.) Assay Buffer (8 ml, IBEX Pharmaceuticals Inc.) Buffer III (20 ml, IBEX Pharmaceuticals Inc.) Wash Buffer (50 ml, IBEX Pharmaceuticals Inc.) CPII Antibody (75 µl, IBEX Pharmaceuticals Inc.) GAR-HRP (75 µl, IBEX Pharmaceuticals Inc.) CPII Standard (200 µl, IBEX Pharmaceuticals Inc.) CPII Elisa Plate (IBEX Pharmaceuticals Inc.) Mixing Plate (IBEX Pharmaceuticals Inc.) Plate Sealers (IBEX Pharmaceuticals Inc.)2.5. ZellkulturmediumChondrozytenmedium: F12 GlutaMAX (250 ml, Gibco, Deutschland) DMEM GlutaMAX (250 ml, Gibco, Deutschland) FCS (50 ml, Biochrom, Deutschland) PenStrep (10 ml, Gibco, Deutschland) Fungizone (6 ml, Gibco, Deutschland) Phosphitan (500 µl, Sigma-Aldrich, Deutschland)10

2.6. Autologe Chondrozyten-Transplantate (ACT)Die Reste aus klinisch verwendeten ACTs (Novocart 3D, Tetec, Deutschland)stammten aus der BG-Unfallklinik Tübingen und waren überschüssiges Materialvon ACTs, die Patienten aufgrund eines Knorpelschadens implantiert wurden.Die untersuchten ACTs wurden von der Firma Tetec in Reutlingen,Deutschland, hergestellt. Tabelle 1 gibt einen Überblick über die Spenderdaten(mittleres Alter: 34,5 Jahre; Standardabweichung: 10,0 Jahre). Die ACTRestgewebe wurden im Originalbehältnis samt Nährmedium ins Laborüberführt.Tabelle 1: Liste der ACT-SpenderNummerAlter nnlich#831männlich#938weiblich# 1027männlich# 1121weiblich# 1252weiblich# 13*weiblich# 1428weiblich* konnte nicht eindeutig erfasst werden, da Patientenetikett fehlte2.7. Humaner Gelenkknorpel aus dem KniegelenkDer humane Gelenkknorpel für die Chondrozytenextraktion stammte aus derBG-Unfallklinik Tübingen und wurde im Rahmen diverser Operationengewonnen. Er wurde in einer Lösung aus DMEM GlutaMAX, PenStrep und11

Fungizone bei einer Temperatur von 4 C postoperativ aufbewahrt. DerKnorpel wurde in der Sterilbank vom Knochen mit einem Skalpell gelöst undanschließend verdaut. Tabelle 2 gibt einen Überblick über die Spenderdaten(mittleres Alter: 79,0 Jahre; Standardabweichung: 3,2 Jahre)Tabelle 2: Liste der KnorpelspenderNummerAlter nlich#482weiblich#579weiblich2.8. Strukturanalyse der 2.8.1.Präparation der autologen Chondrozyten-TransplantateDie ACT-Proben, die den Patienten bereits implantiert wurden und deren Resteuns zur Verfügung standen, waren konstant bei -25 C im Gefrierschrankgelagert. Die weiteren Schritte der Präparation und Färbung fanden alle ineinem gentechnischen Labor der Sicherheitsstufe 1 statt. Für die Präparationwurde die Probe jeweils bei Raumtemperatur erwärmt, bis sich die Suspension,in der das ACT-Stück eingebettet war, verflüssigte.Anschließend wurde der sogenannte Rest, der sich meist in der Form einesRinges vorfand, mit einer anatomischen Pinzette aus dem Behälter entfernt undin eine Petrischale gelegt. Daraufhin wurden mit einem Einmal-Skalpell jeweilsdrei ca. 0,7x0,7 cm große Stücke nach Augenmaß, wenn möglich auf vier, achtund zwölf Uhr, aus dem Ring herausgeschnitten, die dann in ein 50 ml BlueCap gegeben wurden. Die nach der Präparation übriggebliebenen ACT-Restewurden für mögliche weitere Experimente in einem Eppendorf-Reaktionsg

Kollagen Typ II) sind [2]. Histologisch lässt sich der hyaline Knorpel in verschiedene Schichten unterteilen. Er besitzt eine superfizielle, transitionelle, radiäre und kalzifizierte Schicht (Abb. 1). Jede Schicht weist charakteristische Besonderheiten in Morphologie [1, 3, 4], Glykosaminoglykan- [5], Kollagen- [6],